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海藻糖對(duì)生物酶制劑中反應(yīng)中激活劑與穩(wěn)定劑

溫度是影響酶反應(yīng)效率的重點(diǎn)因素之一，高溫能提高酶的催化活力，但易使酶失活。耐熱酶的發(fā)現(xiàn)為分子生物學(xué)帶來(lái)巨大的進(jìn)步，如PCR和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)生，目前局限于從一些耐熱菌中分離得到耐熱酶，而且酶催化反應(yīng)類型也受到限制。研究發(fā)現(xiàn)海藻糖在高溫下能保持酶的正?；钚裕踔疗馃峒せ钭饔?，還能用于提高干燥保存的酶的活性。在反應(yīng)體系中加入海藻糖，使熱敏感的酶在高溫下穩(wěn)定性和活性增加，可當(dāng)作耐熱酶使用，海藻糖的這一作用在生物藥學(xué)和工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。 未加海藻糖的限制性內(nèi)切酶Nocl在溫度由45℃升到50℃時(shí)失活，加了海藻糖時(shí)酶不但不失活而且活力繼續(xù)升高，說(shuō)明海藻糖能抑制高溫下酶的失活；37℃時(shí)海藻糖能夠激活DNasel，加了海藻糖，溫度升到50℃時(shí)酶活力仍顯著升高；豬的胰脂肪酶在無(wú)水海藻糖介質(zhì)中可以耐受100℃高溫，有水時(shí)則會(huì)失活。有實(shí)驗(yàn)表明海藻糖通過(guò)影響蛋白水合作用來(lái)穩(wěn)定和激活蛋白，它可以降低溶液中蛋白質(zhì)的水化作用，干燥時(shí)則能取代水或作為玻璃樣穩(wěn)定劑。海藻糖能阻止酶發(fā)生不可逆的熱凝聚-熱變性，與分子伴侶的功能相類似，實(shí)驗(yàn)中將一些分子伴侶與海藻糖共同使用，能進(jìn)一步擴(kuò)大對(duì)酶具有熱穩(wěn)定和熱激活作用的溫度范圍。另外海藻糖并不是對(duì)檢測(cè)的所有酶都有熱穩(wěn)定和熱激活的作用，說(shuō)明只有一些蛋白可能具有海藻糖識(shí)別和作用的位點(diǎn)。 獲得全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，有利于分子和全長(zhǎng)cDNA測(cè)序，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是構(gòu)建cDNA文庫(kù)的重要反應(yīng)，mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，釋放mRNA/非互補(bǔ)cDNA雜合體，導(dǎo)致合成全長(zhǎng)cDNA效率很低，這是構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)主要的問(wèn)題。以前解決這一問(wèn)題主要是在反應(yīng)前使樣品變性，如熱變性、加氫氧化甲基汞處理mRNA等或者反應(yīng)中提高反應(yīng)溫度。前一類方法對(duì)破壞mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)效果不佳，特別是從長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物獲得全長(zhǎng)的cDNA，而后者雖然對(duì)破壞mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)比較有用，但除了TchDNA聚合酶外，其它反轉(zhuǎn)錄酶者不耐熱，而TchDNA聚合酶催化反應(yīng)需Mn2+，這容易造成mRNA在反應(yīng)前就降解了。實(shí)驗(yàn)證明海藻糖能使鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶具有熱穩(wěn)定和熱激活特性，酶在60℃仍具有全部活性，足以在mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)終止反應(yīng)之前合成全長(zhǎng)的cDNA，反應(yīng)效率大大提高。另外推測(cè)海藻糖可能具有改變核酸構(gòu)型的作用，例如減少反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 生產(chǎn)中利用海藻糖熱穩(wěn)定和熱激活的雙重功能，可以減少酶的用量和提高反應(yīng)速率，提高消耗/產(chǎn)出和時(shí)間/產(chǎn)出比值，在一系列酶反應(yīng)中都有很大潛力，如生化反應(yīng)、診斷或工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，更重要的是熱激活能用于提高反應(yīng)程度和總效率，獲得標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下不可能的產(chǎn)量。另外，利用熱穩(wěn)定和熱激活的作用，可開(kāi)發(fā)以前在常規(guī)反應(yīng)條件下不可能進(jìn)行的反應(yīng)，例如專一性要求特別高的核酸雜交實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系加入海藻糖，就可在適宜的溫度下同時(shí)使用幾種限制/修飾酶，提高雜交反應(yīng)特異性，減少假陽(yáng)性結(jié)果。